Hexarelin y de Biología Reproductiva: GH Peptídeo de secretagogo, mecanismos de modulación del eje gonadal y fertilidad

Este artículo está destinado a investigadores y profesionales de laboratorio. Todos los péptidos discutidos son para uso de investigación solamente (RUO) y no están aprobados para administración humana, uso terapéutico o aplicación clínica. El Hexarelin de calidad de investigación se destina únicamente a investigaciones de laboratorio in vitro e in vivo.

Hexarelin Biología: Ghrelin El agonismo del receptor más allá del hormona de crecimiento

Hexarelin (His-D-2-MeTrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) es un hexapéptido sintético GH secretagogo desarrollado como un potente agonista del receptor de secretagogo de hormona del crecimiento 1a (GHSR-1a, también denominado el ghrelin El tratamiento con el receptor es muy frecuente. Mientras hexarelin fue caracterizado originalmente e investigado ampliamente por su GH-suelta propiedades - estimulante pulsátil robusto GH liberación a través de un mecanismo distinto de GHRH — las investigaciones posteriores han descubierto su interacción con CD36 (receptor del tesoro expresado en tejido cardiaco y órganos reproductivos), GHSR-1b (variante truncada de epístolas), y potencialmente receptores no descritos adicionales, creando un perfil farmacológico más rico que simple GH- estimulación del eje. Para la investigación de biología reproductiva, hexarelinEl significado deriva de la densa GHSR-1a expresión en los tejidos gonadales, el papel establecido de ghrelin/GHSR señalización en HPG modulación del eje y la intersección entre GH/IGF-1 y biología de esteroides sexuales.

GHSR-1a la expresión en los tejidos reproductivos está bien caracterizada: gonadotrópicos hipófis y humanos expresan GHSR-1a junto a GnRH-R; gránulosa ovárica y células teca expresan GHSR-1a ARNm y proteínas (RT- ¿Qué?PCR- Inmunofluorescencia; Células de Leydig del testículo expreso GHSR-1a (relevantes para la regulación de la testosterona); y endometrio uterino y placenta expreso GHSR-1a durante las etapas específicas de la reproducción. Este patrón de expresión del tejido sugiere efectos directos de gonadales de hexarelin independiente de la pituitaria GH Suelta.

HPG Modulación del eje: LH, FSH, y GnRH Interacción con el pulso

Hexarelin y ghrelin ambos modulan el hipotálamo-hipofisario-gonadal (HPG) eje, principalmente a través de efectos sobre GnRH frecuencia de pulso y amplitud a nivel hipotálamo, y a través de la modulación directa de la sensibilidad de gonadotrópica hipofisaria a GnRH- ¿Qué? Investigación utilizando preparaciones hipotálamicas en rodajas y GT1-7 inmortalizado GnRH neuronas demuestran que GHSR-1a suprime la activación GnRH frecuencia de pulso — un mecanismo mediado por el neuropéptido Y (NPY) y a través de las empresas de la Unión Europea. NPY Y1 inhibición acoplada a los receptores de GnRH frecuencia de ardor de las neuronas (electrofisiología, parche-clamp, configuración de sello suelto). Esto ghrelin/hexarelin- ¿Qué?NPY- ¿Qué?GnRH eje de señalización proporciona contexto mecanicista para el hipogonadismo asociado con la desnutrición crónica y estados de déficit energético donde ghrelin está elevado.

In vivo LH el perfil de pulso es el estándar de oro HPG lectura del eje: toma de muestras de sangre en serie por vía yugular o venosa de cola cada 6 minutos durante 3-4 horas, con ultrasensibilidad LH ELISA (Protocolo Steyn, metodología de laboratorio de Shlomo Melmed, límite de detección ~0.016 IU/L Hexarelin (100-500 μg/kg i.v. o i.p.) y la comparación de vehículos en ratas o ratones machos/mujeres intactos permiten cuantificar LH frecuencia de pulso (pulses/3h), amplitud de pulso (IU/L), intervalo interpulsional (minutos), y media LH concentración. GnRH antagonista (acilina, 330 μg/kg s.c.) o GnRH receptor KO los modelos confirman la hipofisis-dependencia frente a los efectos hipotálamos directos. Kisspeptin-10 (10 nmol i.c.v.) sirve como un control positivo para LH inducción de sobrecargas, confirmando HPG la respuesta del eje en el modelo.

Investigación de células de Leydig: GHSR-1a y la biosíntesis de testosterona

La célula testicular Leydig representa un sitio clave de la hexarelin acción en la investigación de biología reproductiva masculina. Células primarias de Leydig aisladas de testículos de ratas adultas (digestión de la colagenasa de testículos de tunica albuginaa, gradiente de paso Percoll 30/55/70%, población purificada ≥85% 3β-HSD positivo por histoquímica enzima) expreso GHSR-1a confirmado por RT- ¿Qué?PCR (primas de engranaje interno) e inmunofluorescencia (anti-GHSR-1a anticuerpos, Abcam ab85985) . Hexarelin tratamiento de células primarias de Leydig (1-100 nM, 3-24h) activa GHSR-1a-Gq-PLCβ-IP3-Ca2+/DAG- ¿Qué?PKC señalización, evaluada por Fura-2 AM Imagen de la relación intercelular de Ca2+ (340/380 nm Emoción, Nikon TiE epifluorescencia) y DAG ensayo (Diacilglicerol Kinase Assay, Sigma).

Endpoints de la biosíntesis de testosterona en hexarelin- cultivos celulares de Leydig tratados: i) la secreción basal de testosterona por RIA o bien LC- ¿Qué?MS/MS en medios condicionados a 3, 6, 24h; ii) LH- producción estimulada de testosterona (hCG 1 IU/mL control positivo) ± hexarelin el tratamiento previo para evaluar la potenciación; iii) StAR (proteína reguladora aguda esteroideogénica) expresión de proteínas por Occidente (anti-StAR, Abcam ab58984, 37 kDa banda) — la escenificación de importación de colesterol mitocondrial que limita la tasa; iv) CYP11A1 (Creoplasto de la cadena lateral), CYP17A1 (17α-hydroxylase/17,20-lyase) y HSD17B3 (17β-hydroxysteroid desidrogenasa tipo 3) mRNA por qPCR (Taqman) cuantificando la cascada completa de enzimas esteroideogénicas. Ensayo de liberación de ácido araquidónico (premarcación con ácido araquidónico [3H]) y ER marcadores de estrés (GRP78, ATF4, CHOP) completar el panel mecanicista para hexarelines la regulación esteroideogénica.

Investigación Ovariana: Célula Granulosa GHSR-1a, la policulogénesis y la esteroidesis

En la investigación de biología reproductiva femenina, las células granulosas ováricas son las principales GHSR-1a-expressing tipo de celda pertinente para hexarelin efectos sobre la foliculogénesis y la producción de hormonas esteroides. Las células de granulosa primarias están aisladas de ratas inmaduras con gonadotropinas (PMSG 10 IU i.p., 48h, Sprague-Dawley 21-day hembras) por aspiración folicular de folículos antrais en MEM con 25 mM HEPES, filtrado a través 40 μm colador celular, platinado a 105 células/cm2 MEM + 1% FBS + insulin/transferrina/selenio. GHSR-1a la expresión es confirmada antes de cada experimento por RT- ¿Qué?PCR y occidental para explicar la reducción de la regulación de los receptores dependiente del paso.

Investigación de esteroidogénesis de células de la granulosa con hexarelina: producción de estradiol (E2) (ELISA, DRG EIA-2693 o Calbiotech ES168S) en cultivos estimulados con FSH ± hexarelina (0.1-100 nM, 24-48h); producción de progesterona (P4) por RIA en cultivos estimulados con LH/hCG; qPCR de mRNA de aromatasa (CYP19A1) y ensayo de actividad ([¹,2-³H]-androstenediona → liberación de [³H]-agua, actividad de aromatasa nmol/h/mg de proteína); expresión de FSHR (RT-PCR, western) rastreando el estado de maduración folicular durante el tratamiento con hexarelina. La expresión de CYP11A1 y StAR en células de la granulosa que experimentan luteinización (simulación de pico de LH con hCG 10 IU/mL) ± hexarelina evalúa el papel de la hexarelina en la respuesta al pico de LH y la formación del cuerpo lúteo. La inmunofluorescencia de Ki-67 y la incorporación de BrdU confirman los efectos proliferativos en células de la granulosa (la FSH es el mitógeno primario; la potenciación por hexarelina se evalúa en relación con la respuesta a dosis de FSH).

GH-IGF-1 Esteroidogénesis del eje y de las gonadas: Mecanismos sinérgicos

HexarelinEs pro-GH los efectos crean una dimensión indirecta de la biología reproductiva a través de la GH-IGF-1 eje. IGF-1 receptores (IGF-1R) se expresan abundantemente en las células de Leydig y en las células de granulosa, y IGF-1 actúa sinérgicamente con gonadotrofinas (LH en las células de Leydig, FSH en células de granulosa) para potenciar la esteroidegénesis. Disecación de la investigación GH-IGF-1 contribuciones de los ejes hexarelinLos efectos reproductivos emplean: i) GH antagonista del receptor pegvisomant (selectivo GHSR bloqueador para el GH- brazo dependiente); ii) IGF-1 anticuerpos neutralizantes (R)&D AF-291-NA- El Sr. iii) inhibición de la fosfatasa IGF-1R → IRS-1 → PI3K-Akt vía de LY294002 o Wortmannin a nivel de células gonadales; y iv) modelos animales hipofisectomizados (Hx) en los que: hexarelinEl gonadal directo GHSR-1a los efectos pueden evaluarse sin hipofisis GH secreción confusa.

En ratas Hx suplementadas con fisiología GH (0.1 mg/kg/día s.c. para restaurar GH sin hexarelin estimulación), hexarelin el tratamiento produce efectos residuales sobre el peso testicular, la testosterona plasmática y las células de Leydig StAR expresión atribuible a la GHSR-1a acción. Esto GH-componente independiente se confirma más con [D-Lys3]-GHRP-6 (GHSR-1a antagonista, 20 μg/kg i.p.) en animales intactos: lleno GHSR bloqueo elimina hexarelinEfecto sobre el pulsatilo GH pero sólo parcialmente atenua las respuestas esteroideogénicas gonadales, consistentes con non-GHSR-1a Mecanismos de mediación (CD36, efectos directos de la membrana) contribuyendo a las respuestas del tejido reproductivo.

Modelos de investigación sobre la fertilidad masculina: Parámetros del esperma e histología testicular

Investigación de fertilidad masculina translacional con hexarelin emplea modelos de roedores adultos sanos e hipogonadales. En ratas machos adultas Sprague-Dawley (250-300g, tratamiento 4-8 semanas Artículos de la partida 84 hexarelin 100-500 μg/kg/día), evaluación de los parámetros espermáticos: i) concentración de esperma (hemocitometro Neubauer, vasos deferentes y epididimis cauda) BWW medio); ii) la motilidad progresista total y la motilidad progresiva rápida (WHO criterios, CASA — SCA o Hamilton-Thorne IVOS II análisis automatizado; iii) morfología (tinción de Diff-Quik, ≥200 espermatozoides contados, normales frente a defectos de cabeza/medio/talla %; iv) esperma DNA índice de fragmentación (DFI) mediante el ensayo de la estructura de la cromatina (SCSA) o bien TUNEL citometría de flujo (≤15 % DFI El umbral de la ayuda es el umbral). Histología testicular (4%) PFA, parafina, H&E 5 μm): Puntuación de Johnsen (1-10) para las etapas espermatogénicas, diámetro del túbulo senifero, fracción de volumen de las células de Leydig (estereología de contador de puntos) y relación de las células de Sertoli (número/sección transversal de los túbulos).

Modelos de investigación hipogonadales que utilizan hexarelin- ¿Qué? i) Estrés crónico de retención (CRS, 6h/día × 21 días) induce hipogonadismo funcional hipogonadotrófico con reducción de la LH Frecuencia de pulso y testosterona — hexarelin el rescate de la GH- componente eje de la supresión reproductiva inducida por el estrés; ii) Estreptozotocina (STZ, 55 mg/kg i.p.) modelo diabético — T1DM-induced disfunción testicular con estrés oxidativo (MDA- ¿Qué?TBARS, GSH, catalasa, SOD en homogenado testicular), apoptosis de células de Leydig (TUNEL, caspase-3 IHC), y esteroidegénesis alterada corregible por hexarelinantioxidante GHSR-1a señalización por medio de NRF2-HO-1-NQO1 la vía; iii) agua de alcohol inducida (etanol 20% v/v, agua potable, 8 semanas) disfunción testicular con parámetros oxidativos y apoptóticos similares.

Modelos de fertilidad femenina: Investigación Policística de Ovario y Reserva Ovaria

El síndrome poliquístico de los ovarios (PCOS) el modelo de investigación más comúnmente utilizado es el letrozolo (inhibidor de la aromasa) o DHT (dihydrotestosterone) modelo de implante en ratas hembras. Letrozolo (1 mg/kg/día de gavaje, 21 días) produce PCOS- características similares: elevado LH- ¿Qué?FSH Relación, aumento de la testosterona, morfología ovárica poliquística (≥12 folículos antrais/ovario en ultrasonido o histología, diámetro del quista folicular ≥0.25 mm sobre el tema H&E), anovulación (citología de la frotis vaginal — cornificados persistentes/diestros), y características metabólicas (IR- ¿Qué?HOMA, OGTT) . Hexarelin tratamiento en letrozolesPCOS ratas evalúan HPG restauración del eje, normalización de enzimas esteroideogénicas y rescate del desarrollo folicular con GH-IGF-1 intersección de ejes pertinente para PCOS desde entonces GH resistencia y IGF-1 el exceso caracteriza el PCOS microambiente ovárico.

La investigación de reserva de ovarios utiliza hormona anti-mülleriana (AMH) como biomarcador primario: suero AMH ELISA (Ansh Labs, ng/ml) que reflejan el pool folículo primordial y pre-antral. Conteo de folículos primordiales por estereología imparcial (fraccionador óptico, investigador estereo) en ovarios seccionados en serie (10 μm, H&E) proporciona el punto final de la reserva ovárica estándar oro. Ratón hembra envejecido (10-12 meses) en la que se hexarelin tratamiento (crónico 4-8 semana c.c.) en comparación con los jóvenes (3-4 mes) controles, medición AMH, recuento de folículos antrales (AFC, ultrasonido vaginal o H&E recuento histológico), y la regularidad del ciclo estroso (citología vaginal diaria), abordar la intersección de GH biología secretagoga y envejecimiento reproductivo.

Placentaria y uterina GHSR-1a Expresión: Investigación sobre implantación

GHSR-1a expresión en células trofoblasticas humanas (HTR-8/SVneo, JEG-3, BeWo) y citotrofoblastos primarios de primer trimester (isolados por el gradiente Percoll de villi coriónico) permite la investigación de hexarelin/ghrelin señalización en la colocación temprana. Los objetivos de la investigación incluyen: invasión de trofoblastos (Matrigel-cubierto Boyden 8 μm insertar, 48h, DAPI- células invasoras en la parte inferior, cuantificación de fluorescencia; migración de trofoblastos (rañazo de heridas, IncuCyte S3 automatizado 2h- imágenes de intervalos); secreción de metaloproteinasa de matriz (MMP-2, MMP-9 zimografía y ELISA- "Luminex"; y producción de hCG (β-hCG ELISA en medios acondicionados, DRG diagnósticos) como marcador de diferenciación funcional de trofoblastos.

Investigación de la receptividad uterina con hexarelin se centra en el desarrollo de la glándula endometrial y la señalización de ventanas de implantación. HOXA10 y HOXA11 (factores de transcripción críticos para la receptividad uterina, ventana día 4 de pseudogravidez en ratones) expresión por inmunohistoquímica y qPCR en uteri de hexarelin-tratado ovariectomizado E2/P4-primed los ratones abordan el papel de GHSR-1a señalización en preparación endometrial. Densidad de los pinópodos (microscopia electrónica de transmisión, pseudogravidez del día 4) y LIF (factor inhibidor de la leucemia, ELISA) y, HOXA10, e integración αvβ3 marcar la ventana de implantación — todo potencialmente modulado por hexarelinLos GH/IGF-1 efectos del eje sobre la biología uterina.

CD36 Receptor: No sonGHSR Mecanismo en tejidos reproductivos

Hexarelin"la alta afinidad que se vincula a CD36 (un receptor del tesoro/transloca de ácido graso expresado en macrófagos, adipocitos, endotelio y células esteroideógenas) representa una vía mecanísticamente distinta de GHSR-1a Activación. CD36 se expresa en el cuerpo lúteo ovárico, células testiculares Leydig y trofoblastos placentarios, donde media la captación de colesterol (sustrato de esteroidesis esencial) y el transporte de ácidos grasos. Investigación utilizando [125I]-hexarelin ligando radio en GHSR-1a-null sistemas celulares (confirmación CD36 como socio vinculante) y CD36-selective antagonista SSO (sulfo-N-succinimidilo oleato, 10 μM) disecciones GHSR-1a-independent hexarelin efectos en las células esteroideogénicas. CD36-mediated aumento de la captación de colesterol (BODIPY-marcador fluorescente de colesterol, citometría de flujo) y StAR-importación independiente de colesterol mitocondrial en hexarelin-las células Leydig tratadas proporcionan lecturas mecanísticas para la vía de biología reproductiva no canónica.

Diseño de Control para Investigación de Biología Reproductiva

La investigación reproductiva rigurosa con hexarelina requiere: (i) estadificación del ciclo estral — todos los experimentos con hembras cronometrados según la etapa definida del ciclo (proestro, estro, metestro, diestro) por citología vaginal, ya que la respuesta hormonal varía dramáticamente a lo largo del ciclo; (ii) controles de especificidad de GHSR-1a — [D-Lys³]-GHRP-6 (antagonista de GHSR-1a) y el antagonista de CD36 SSO administrados por separado y en combinación para atribuir completamente los efectos a cada receptor; (iii) disección del eje de GH — modelo Hx o el antagonista del receptor de GH pegvisomant para efectos gonadales de GHSR-1a independientes de GH; (iv) controles de gonadotropina — hCG (sustituto de LH, 1-10 IU/mL in vitro o 10 IU i.p. in vivo) como control positivo de estimulación esteroidogénica máxima; (v) ELISAs de hormonas sexuales — kits de ensayo validados con reactividad cruzada apropiada para la especie (roedor vs humano); (vi) cronometraje diurno — la liberación de GH por hexarelina es circadiana (pulsátil en roedores con mayor amplitud durante la fase temprana de oscuridad), requiriendo protocolos de dosificación y muestreo en tiempo fijo; (vii) pureza del péptido — ≥98% HPLC, confirmación de masa por LC-MS/MS, endotoxina ≤1 EU/mg (la endotoxina puede estimular directamente la esteroidogénesis gonadal vía TLR4, confundiendo los resultados).