LL-37 y Gut Microbiome Research: Biología de la barrera intestinal, modulación de la disbiosis e inmunidad mucosa

Sólo uso de investigación. No para uso terapéutico humano o veterinario. Todo el contenido se proporciona únicamente con fines de referencia científica y educativa.

LL-37, el único péptido antimicrobiano de catelicida humana (AMP) se expresa constitutivamente en todo el tracto gastrointestinal —desde el epitelio gástrico hasta el intestino delgado hasta el colon—, donde desempeña papeles fundamentales en la inmunidad de la mucosa intestinal, el mantenimiento de la barrera epitelial y la compleja interacción bidireccional con el microbioma intestinal. Entendimiento LL-37La biología gastrointestinal es esencial para la investigación de enfermedades inflamatorias intestinales (IBD) , patología impulsada por disbiosis, disfunción de la barrera intestinal, e infección entérica. Esta diva profunda cubre los mecanismos, sistemas modelo y puntos finales más relevantes para la investigación del microbioma intestinal y la inmunidad mucosa.

LL-37 en el Tracto gastrointestinal

Patrón de expresión y regulación

LL-37/catelicida (codificada por el CAMP gên) se expresa en colonocitos, enterocitos, células de Paneth (que también expresan α-defensins HD-5 y HD-6), células de cáscara y macrófagos intestinales. La expresión es regulada por: Ácidos grasos de cadena corta (SCFAs, en particular el butirato, a través de HDAC inhibición en la CAMP promotor), vitamina D3/VDR-RXR señalización (directa) VDR-elemento vinculante en CAMP promotor), y receptor de reconocimiento de patrón (PRR) participación, incluida la NOD2 Activación. Criticalmente, formas de composición de microbiota intestinal LL-37 expresión: SCFA-productores de comensales (Faecalibiacterium prausnitzii, Roseburia intestinalis, Akkermansia muciniphila butyrate productors) propulsan el butyrate-dependiente CAMP upregulation, estableciendo una retroalimentación positiva entre el microbioma salud y el peptídeo de defensa del hospedero.

LL-37 y la composición del microbioma Gut

LL-37 no es un simple antimicrobiano de amplio espectro en el contexto intestinal, su actividad selectiva contra especies microbianas forma la composición del microbioma. Caracterización de la investigación LL-37La actividad antimicrobiana diferencial contra la especie intestina comensal vs patobiont revela:

• Alta actividad contra los patobiontes: Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Clostridium difficile (MIC caracterización por microdilución de caldo en condiciones anaeróbicas)
• Resistencia relativa en comensales: Las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium muestran una reducción LL-37 susceptibilidad debido a las diferencias de arquitectura de la pared celular, consistentes con LL-37"el papel selectivo de la meta de la meta
• F. El proyecto de resolución supresión de nucleatos: relevante para la investigación del cáncer colorrectal donde F. nucleatum provoca evasión inmune asociada a tumores — LL-37 MIC ≤4 μg/mL contra CRC- F asociado. cepas de nucleatum
• C. El Sr. inhibición difícil: MIC/MBC caracterización en condiciones de crecimiento relevantes (modelo de fermentación in vitro, pH del colon 6.0, suplementación de mucina a condiciones in vivo aproximadas)

Biología de la barrera intestinal

Reglamento de unión apretada

La integridad de la barrera intestinal depende de la unión estrecha (TJ) proteínas incluyendo: claudin-1, claudin-3, claudin-4, ocludin, ZO-1, y molécula de adhesión de la unión (JAM- A). LL-37 modula TJ expresión y función a través de EGFR- ¿Qué?MAPK activación de la vía: el mismo mecanismo de transactivación documentado en el epitelio respiratorio. En las células epiteliales intestinales (IEC) líneas (Caco-2, T84, HT-29) y, LL-37 aumentos del tratamiento TEER (resistencia eléctrica transepitelial) —una medida funcional de integridad de la barrera paracelular— y restaura TJ expresión de proteínas después LPS, TNF-α, o la interrupción de la barrera inducida por la hipoxia.

Endpoints de la investigación para LL-37 investigación de la barrera intestinal: TEER (Evom2 voltómetro con STX-2 electrodos en inserciones Transwell), FITC- ensayo de permeabilidad dextran (4 kDa) FITC- D en 1 mg- ML apical; Basolateral FITC fluoremetría), claudin-1/occludin/ZO-1 inmunofluorescencia y imágenes confocales de pilas Z (localización conjunta vs puntuación de deslocalización citoplasmática), y TJ cuantificación de proteínas por blot occidental del lisato celular y fraccionamiento de membrana.

Biología de las células de capa de muco y de cacahuete

La capa de mucoso intestinal (predominantemente MUC2 El polímero de glicoproteína en el colon) proporciona una barrera física entre las células epiteliales y las bacterias luminales. LL-37 está incrustado dentro de la capa de mucoso, creando una zona de actividad antimicrobiana en la interfaz host-microbioma. LL-37 estimula MUC2 expresión en células de cacahuete (HT-29 5F12 línea celular de goma, células primarias de goma derivadas de colonoides) a través de TLR activación y NF-κB-dependent MUC2 inducción del promotor.

Instrumentos de investigación: PAS/Tintura de mucosidad azul alcia (cuantificación histológica e ImageJ), MUC2 ELISA a partir de medio apical acondicionado, cuantificación de la proporción de células de cacahuete (MUC2+ celdas por unidad de cripta por IHC) y microscopía electrónica del espesor de capa de muco en segmentos intestinales ex vivo.

Modelos de investigación de enfermedades inflamatorias de la intestina

LL-37 Disregulación en IBD

LL-37 la expresión es paradójicamente desregulada en IBD- ¿Qué? elevado en la enfermedad de Crohn activa (CD) tejido colónico vs reducción en colitis ulcerosa (UC) mucosa quiescente, con patrones inversos en activo UC dependiendo de la ubicación de la enfermedad. Esta expresión dependiente del contexto es relevante para la investigación: LL-37El potencial proinflamatorio (TLR7/8-mediated la activación celular dendrítica cuando se complemente con ácidos autonucleicos) puede contribuir a CD-desregulación inmune asociada, mientras que LL-37 deficiencia en UC puede afectar la defensa mucosa y la reparación epitelial.

DSS Modelo de colitis

Dextran sulfato de sodio (DSS, 2–5% en agua potable para 5–7 días) interrumpe la barrera de la mucosa colonica — LL-37El sitio funcional principal — generando un IBD- fenotipo similar con acortamiento del colon, diarrea sangrienta, pérdida de peso y colitis histológica. Los DSS modelo es especialmente adecuado para LL-37 investigación porque su mecanismo primario (interrupción de barreras que permite la translocación bacteriana y la activación inmune) implica directamente LL-37las funciones protectoras de la barrera.

DSS objetivos finales: DAI (Índice de actividad de enfermedad: pérdida de peso + consistencia de las heces + sangrado rectal, 0–12), longitud del colon (cm, variable antiinflamatoria), MPO ensayo de actividad (homogenado de tejido, trinder/colorimétrico), multiplex de citocinas ELISA (IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-10, IFN-γ de tejido colónico), puntuación histológica (partitura Geboes o puntuación Barón modificada: arquitectura cripta, infiltrado inflamatorio, daño epitelial, pérdida de células de cacahuetes), FITC- permeabilidad intestinal dextrana in vivo (gavaje oral, fluoremetría sérica).

TNBS Modelo de colitis

La instilación intrarrectal de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) genera una colitis transmural tipo CD inducida por hapteno con perfil inmunitario Th1/Th17 (en contraste con el perfil predominantemente innato/Th2 del DSS). La modulación por LL-37 del equilibrio Th1/Th17 frente a Treg a través de la activación de DC y la polarización de citocinas es relevante aquí. Endpoints: curva de supervivencia TNBS, trayectoria de pérdida de peso, colonoscopia (puntuación endoscópica), multiplex de IL-12p70/IL-17A/IFN-γ/TGF-β1/IL-10 de esplenocitos de ganglio linfático mesentérico (ELISPOT y ELISA de reestimulación), y citometría de flujo de Treg CD4+FoxP3+ del aislado de linfocitos de lámina propia (LPL).

Sistemas organoideos/colonoides

organoides intestinales derivados del paciente (colonoides de IBD biopsias quirúrgicas saludables) permiten LL-37 investigación en un contexto de tejido humano genéticamente relevante. Ensayos colonoides estándar para LL-37 biología: TEER- resistencia equivalente a la cúpula Matrigel, TNF-α-driven Rescate por trastorno de la barrera (LL-37 tratamiento previo), CAMP expresión de los genes por RT-qPCR (nivel de referencia y butyrate/VitD3-stimulated) y una sola celda RNA-seq transcriptome comparación de LL-37-tratado frente a los colonoides del vehículo para la resolución de la vía.

Investigación de patógenos entéricos

C. El Sr. biología de la infección difícil

Clostridioides difíciles (CDI) es un patógeno entérico importante, particularmente la interrupción post-antibiótica del microbioma intestinal. LL-37actividad antimicrobiana contra C. células vegetativas difíciles y esporas, combinadas con su función protectora de barrera epitelial (prevención del acceso a la mucosa de toxina A/B), la coloca como una herramienta de investigación relevante para CDI biología. Sistemas de ensayo: Microdilución del caldo anaeróbico (BHI, 37°C anaeróbica), infección monocapa colonoide ex vivo (toxina A/B-GFP reportero de fusión, TEER medición sobre 24h) y in vivo CDI modelo de ratón (antibiótico cóctel pre-tratamiento, C. el gavaje difícil de esporas, LL-37 tratamiento previo/post, CFU cultura fecal, histología cecal, toxina A ELISA de contenido cecal).

Salmonella y defensa patógena invasiva

Salmonella entero serovar La infección por Typhimurium del epitélio intestinal implica la invasión de células M y enterocitos por tipo III sistema de secreción (T3SS) . LL-37 interrumpe S. Membranas de tifimurio en MIC 2–8 μg(LB y puede interferir con T3SS-mediated Invasión (ensayo de invasión: ensayo de protección de la gentamicina en Caco-2 células, CFU El recuento de los casos). Los ASF (flora de Schaedler alterada) o ratón libre de gérmenes colonizado con comensales específicos permite la investigación de CAMP-Lumina impulsada LL-37 niveles para determinar la resistencia a la colonización de Salmonella.

LL-37 y el eje Gut-Crain

El eje intestino-cerebro se modula mediante señales inmunes de la mucosa, incluyendo: AMPs- ¿Qué? LL-37 activa glia entérica (GFAP+ células en el plexo mienterico) a través de FPR2/FPRL1 señalización de receptores, influencia en la liberación de neurotransmisores y ENS (Sistema nervioso entérico) actividad. En ratones libres de gérmenes y tratados con antibióticos, que muestran una reducción de la cantidad de animales que se encuentran en la zona de la Unión Europea. LL-37 expresión y alteración ENS fisiología — LL-37 la administración puede restaurar patrones de motilidad intestinal y mucosaENS Comunicación. Endpoints de la investigación: Cartografía espacial (STM) de contracciones de propagación del colon, FPR2 expresión en los gánglios mientericos (IHC) y glial entérica GFAP/S100β/p75NTR Fenotipos.

Paradigma de investigación de la disbiosis

LL-37 deficiencia (CAMP KO modelo de ratón, o agotamiento de butirato a través de la interrupción del microbioma inducida por antibióticos) genera un patrón de disbiosis predecible: expansión de patobiontes, reducción de la diversidad de la comensal, deterioro de la función de la barrera. 16S Secuenciación de los amplificadores de ARNr (V3-V4 región, Illumina MiSeq; ASV análisis por QIIME2/DADA2) de microbiomas fecales y adherentes a la mucosa proporciona los criterios de composición del microbioma. Metagenómica de Shotgun (Illumina de lectura corta o Oxford Nanopore de lectura larga) permite el análisis funcional del metagenoma. KEGG cartografía de la vía, inventario de genes de resistencia a antibióticos, identificación de genes de biosíntesis bacteriocina.

LL-37 reposición (administración subcutánea, intrarectal o oral en formulaciones recubiertas de entéricas con fines de investigación) en CAMP KO o disbióticos y la evaluación de la restauración del microbioma proporciona un marco experimental controlado para LL-37El papel de la regulación microbiométrica.

Resumen de las aplicaciones de investigación

Consideraciones normativas

La investigación de microbiomas con ratón libre de germen o gnotobiótico requiere instalaciones especializadas (isoladores flexibles de películas, carcasa estéril). El tratamiento de datos de secuenciación metagenómica requiere el cumplimiento de la gobernanza de los datos. Todos los modelos de colitis in vivo requieren licencia de proyecto de oficina de hogar en ASPA 1986 con criterios de valoración apropiados (máximo) DAI puntuación, umbrales de pérdida de peso corporal). C. El Sr. difícil trabajo in vivo requiere de la contención de Hazard Group 2 (CL-2) . LL-37 para la investigación de cultivo celular requiere pruebas de endotoxina <0,1 EU/ml para prevenir LPS-interrupción de la barrera impulsada confusión.

Toda la información presentada es para fines de investigación científica y educación. LL-37 no está aprobado para uso terapéutico en humanos. La investigación debe realizarse de conformidad con las directrices institucionales, reglamentarias y éticas aplicables.