Kisspeptin-10 y la investigación de la obesidad: GnRH Mecanismos de modulación del eje, señalización metabólica y homeostasia energética

Este artículo está destinado únicamente a fines de investigación y educación. Kisspeptin-10 es un uso de investigación solamente (RUO) compuesto suministrado para investigación de laboratorio. No está aprobado para uso humano, no es un medicamento y no debe administrarse a seres humanos o animales fuera de los entornos de investigación autorizados.

Introducción: Kisspeptin en la Intersección de Reproducción y Metabolismo

Kisspeptin — el producto de la KISS1 gen — es más conocido como el neuropéptido de GnRH generación de pulso en el hipotálamo. Sin embargo, el KISS1R (GPR54) se expresa mucho más allá del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal, con expresión funcional en tejido adiposo, páncreas β-cells, hígado y tejidos metabólicos periféricos — posicionamiento kisspeptin en la intersección de la regulación reproductiva y metabólica. Esta dimensión metabólica de kisspeptin la biología es objeto de creciente interés en la investigación, particularmente en el contexto de la supresión reproductiva asociada a la obesidad (hipogonadismo funcional en la obesidad), tejido adiposo kisspeptin señalización, homeostasia de glucosa y regulación de la ingesta de energía.

Kisspeptin-10 — el 10-amino fragmento ácido C-terminal biológicamente activo (Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2) — se mantiene completo KISS1R actividad agonista y es la forma de investigación más utilizada. Este post examina la base mecanística para kisspeptin-10La biología relevante para la obesidad, distinta de sus papeles establecidos en la neuroendocrinología reproductiva y la investigación de fertilidad.

KISS1 y KISS1R Expresión en tejidos metabólicos

KISS1R (GPR54) la expresión en los tejidos metabólicos periféricos ha sido confirmada por RT- ¿Qué?PCR, hibridación in situ, e inmunohistoquímica en tejido adiposo (ambos WAT depósitos y BAT) , islotes pancreáticos (β-cells y α-cells) , hígado y músculo esquelético. KISS1 El ARNm (el precursor del ligando) se expresa en el propio tejido adiposo, especialmente en el adiposo visceral, lo que aumenta la posibilidad de que se produzcan kisspeptin- ¿Qué?KISS1R señalización autocrina/paracrina en adiposo independiente de la hipotálamo kisspeptin producción.

En el hipotálamo, el núcleo arcuato (ARC) kisspeptin neuronas co-expresan neurocinina B (NKB) y dinorfina (denominada KNDy neuronas) e integrar señales metabólicas (leptina, insulin, ghrelin, glucosa) con GnRH generación de pulso. Los ARC kisspeptin la población es el mediador principal de los efectos estimuladores de leptina sobre GnRH Pulsatilidad KISS1R el GnRH neuronas reciben kisspeptin la información, y ARC kisspeptin disminución de la actividad neuronáutica en la obesidad (reducción KISS1 ARNm en ARC por hibridación in situ), proporcionando una explicación mecanística para el hipogonadismo hipogonadotrópico asociado a la obesidad.

KISS1R la expresión en adipocitos es detectable por la unión por radioligando ([125I]-kisspeptin-10 de competencia) y funcionales HTRF cAMP o IP1 ensayo (KISS1R parejas a Gq-PLCβ-IP₃-Ca2+ en la mayoría de los tipos de celdas; también Gi y G12/13 enganche notificado) en diferenciado 3T3-L1 adipocitos y adipocitos subcutáneos primarios humanos. El Kd para kisspeptin-10- ¿Qué?KISS1R La unión en adipocitos está en el rango nanomolar bajo, similar a la afinidad de unión de tejido hipotálamo.

Asociado a la obesidad Kisspeptin Disregulación del sistema

En la obesidad inducida por la dieta (DIO) C57BL/6 ratones (HFD 60 % de grasa kcal, 12–20 semanas) y, ARC KISS1 El ARNm se reduce progresivamente — cuantificado por fluorescente ISH (RNAscope) e hibridación in situ en el fondo de la coexpresión del receptor de leptina (LepR) correspondiente a atenuado GnRH Pulsatilidad y reducción LH frecuencia de pulso (medida mediante muestreo serial de sangre de la cola y la vena cada 6 minutos durante 3 horas, LH por ultrasensible ELISA; Steyn y otros (protocolo). Esto constituye hipogonadismo funcional de la obesidad, distinto del fallo gonadal primario.

Plasma kisspeptin concentraciones en DIO animales (medidos por RIA o sensibles ELISA; normalidad de laboratorio de referencia 1–10pM en roedores) se reducen o se modifican dependiendo de la duración y gravedad del modelo. La principal perturbación mecanística no está circulando kisspeptin concentración, pero más bien ARC kisspeptin sensibilidad de las neuronas a las señales metabólicas, especialmente la leptina, que normalmente estimula ARC kisspeptin neuronas vía LepRb-JAK2-STAT3 señalización. En la resistencia a la leptina central asociada a la obesidad (hipotálamo atenuado STAT3 pTyr-705 en respuesta a la leptina periférica), ARC kisspeptin neuronas reciben una leptina trófica insuficiente, reduciendo KISS1 expresión y GnRH Frecuencia de pulso.

Derivados de la adiposidad kisspeptin es una esfera emergente: KISS1 ARNm en VAT es mensurable por qPCR, y VAT explante de medios acondicionados contiene kisspeptin-material inmunoreactivo detectable por RIA- ¿Qué? En la obesidad, VAT KISS1 la expresión se altera de una manera específica de especie y sexo, y el VAT kisspeptin- ¿Qué?KISS1R el bucle autocrino en los adipocitos es un potencial modificador de la función adipocito (metabolismo de los lípidos, secreción de adipocina) separado de la hipotálamo kisspeptin- ¿Qué?GnRH biología.

Kisspeptin-10 y Biología del Islote Párcrea: Insulin Secreción

KISS1R expresión en el páncreas β-cells y α-cells proporciona un vínculo directo entre kisspeptin y homeostasia de glucosa. Kisspeptin-10 potencia la glucosa estimulada insulin secreción (GSIS) en islotes aislados de ratón y MIN6 β-cell línea a través de Gq-PLCβ-IP₃-SR Señalización Ca2+ — la misma vía que amplifica GSIS en respuesta a GLP-1 y colecistokinina. IPLa liberación intracelular de Ca2+ dependiente de 3R es mensurable por Fura-2 AM imagen ratiométrica (340/380nm relación de excitación) en islotes aislados o MIN6 células perifundidas con 11mM glucosa y kisspeptin-10 en 0.1–100nM.

Perifusión dinámica de islotes (sistema de perifusión de BioRep Technologies; 16 islotes por columna en ECM gel; 11mM estimulación de los pasos de glucosa; 100µL/min flujo; 2-minute recolección de fracciones para insulin RIA o bien HTRF) caracteriza la primera fase (0-10 minutos) y la segunda fase (10-30 minutos) insulin mejora de la secreción producida por kisspeptin-10- ¿Qué? El perfil de potenciación similar a la de la incretina (aumentación de la GSIS sin insulin secreción en glucosa basal 2.8mM) puestos kisspeptin-10 como una glucosa-dependiente insulin secretagogue — mecanísticamente relevante para la obesidad asociada insulin alteración de la secreción.

En la obesidad y type-2 modelos de roedores de diabetes (ratón db/db; ZDF ratas; HFD 16-week C57BL/6) y, KISS1R expresión en β-cells se altera (se ha notificado una reducción en algunos modelos, sugiriendo una regulación compensatoria de aumento o reducción de la regulación en función de la estadio de la enfermedad y de las especies). Exógenos kisspeptin-10 (1–10nmol/kg i.v. o i.p.) en DIO animales hiperglucémicos producen suero mensurable insulin elevaciones durante el ensayo de tolerancia a la glucosa (GTT; 2g/kg glucosa i.p. en el momento 0, glucosa en sangre por glucómetro a −15, 0, 15, 30, 60, 120 minutos) y insulin prueba de tolerancia (ITT; 0.75IU/kg insulin i.p.), con un área debajo de la curva de glucosa (AUC glucosa) y la superficie bajo insulin curva (AUC insulin) como puntos finales primarios.

Efectos directos de tejido adiposo: Lipólisis, Lipogénesis y Biología de la Adipocina

KISS1R activación en adipocitos a través de Gq-PLCβ-Ca2+-PKC la señalización modula el metabolismo de lípidos a través de ambos directos PKC- Fosforilación mediada de enzimas reguladoras de lípidos y a través de efectos transcripcionales posteriores sobre la expresión de genes lipogénicos. En los casos diferenciados 3T3-L1 adipocitos (día 8-12), kisspeptin-10 el tratamiento produce efectos dependientes de la concentración en la liberación de glicerol (endpoint de lipólisis); Incorporación libre de reactivo de glicerol colorimétrico) y [14C]-acetato en ácidos grasos (DNL el objetivo final; Conteo de la cintilación de extracción de la foja).

La dirección de los efectos de la kisspeptina sobre la lipólisis en adipocitos se reporta como estimulatoria en algunos estudios (fosforilación de HSL mediada por PKC en sitios no-PKA) e inhibitoria en otros (acoplamiento de Gi en adipocitos reduciendo el eje cAMP-PKA-HSL), sugiriendo que la estequiometría de acoplamiento de KISS1R en adipocitos puede diferir entre estudios debido a diferencias de línea celular, estado de diferenciación, y rango de concentración. Los diseños de investigación deben, por lo tanto, incluir la unión de [¹²⁵I]-GTP-γ-S para evaluar el patrón de activación de proteína G (Gq vs Gi vs Gs) en la preparación de adipocitos específica utilizada, antes de interpretar los hallazgos lipolíticos/antilipolíticos.

Secreción de adipocina en respuesta a kisspeptin-10 incluye adiponectina (antiinflamatoria, insulin- Sensibilización; ELISA en medios acondicionados en 24h y 72h), leptina (pro-inflamatorio en exceso, saciedad-señal) y resistina. KISS1R en adipocitos puede regular la transcripción de adiponectina a través de PPAR-γ — medibles por: PPAR-γ Tyr-273 Fosforilación (CDK5-mediated; inhibida por kisspeptin- ¿Qué?PLCβ-PKC vía de transporte) y PPAR-γ-response elemento luciferasa reportero en 3T3-L1- ¿Qué? Oligomerización de adiponectina (total vs. HMW la relación de adiponectina; cromatografía de filtración de gel) se evalúa por separado como HMW la adiponectina es la forma biológicamente activa en AdipoR1/2- ¿Qué?

Centro Kisspeptin-10- ¿Qué? Circuitos hipotálamos de balance energético

ARC kisspeptin neuronas integrar señales metabólicas que modulan no sólo GnRH Pulsatilidad pero también circuitos de homeostasia de energía. Los ARC contiene dos poblaciones neuronales principales del balance energético: AgRP/NPY (orexigénico) y POMC/CART neuronas (anorexigénicas), ambas reguladas por la leptina y la leptina. insulin- ¿Qué? ARC kisspeptin las neuronas proyectan y reciben proyecciones de ambas poblaciones, y kisspeptin-10 Artículos de la partida 84 la administración influye en la ingesta de alimentos y el gasto energético de manera que sea parcialmente GnRH- independiente.

En ratones, kisspeptin-10 Artículos de la partida 84 (1–10nmol en 2µL aCSF) reduce 1-hour y 2-hour realimentación de la ingesta de alimentos después de ayunar durante la noche (medida por una supervisión precisa del equilibrio continuo en jaulas metabólicas individuales), reduce 24-hour la ingesta acumulada de alimentos y aumenta el gasto energético medido por calorimetría indirecta (jaulas metabólicas); Consumo de oxígeno VO2 años, CO2 producción VCO2 años, RER = VCO2/VO2, producción de calor por ecuación de Lusk). GnRH-la independencia de estos efectos es probada por GnRH antagonista (cetrorelix) 10µg/kg s.c.) pretratamiento, o en GnRH- animales nocturnos receptores.

Centro kisspeptin-10 efectos sobre el peso corporal y la composición sobre la icv crónica perfusión (alzet osmótica minipump, 7–28 días, 1nmol/día) en DIO los ratones proporcionan un modelo crónico para la investigación de la homeostasia energética. La composición corporal de la EchoMRI (masa grasa, masa magra), la ingesta de alimentos por pesaje continuo en jaula metabólica y la actividad física (locomotor de campo abierto, rotaciones de ruedas en marcha) son los principales criterios crónicos. Los controles de la alimentación en pareja son esenciales para distinguir los efectos metabólicos directos de los kisspeptin-10 de efectos secundarios de la reducción de la ingesta de alimentos.

Kisspeptin-10 y Metabolismo Hepático

El hígado expresa KISS1R ARNm y proteínas (RT- ¿Qué?PCR y bloque occidental en tejido de biopsia hepática humana y homogenado hepático de roedores), y hepático kisspeptin la señalización está implicada en la regulación de la producción de glucosa. Kisspeptin-10 suprime la producción hepática de glucosa (HGP) en HepG2 células a través de Gq-PLCβ-Ca2+-PKC-mediado PEPCK (fosfoenolpiruvato de carboxiquinasa; PCK1) supresión de la transcripción, reduciendo la gluconeogénesis. Esto es relevante mecanísticamente para la sobreproducción hepática de glucosa asociada a la obesidad y la hiperglucemia ayunas.

Ensayo de tolerancia de piruvato (PTT; 2g/kg de piruvato de sodio i.p. en 18h animales en ayuno) proporciona una medida in vivo de la capacidad gluconeogénica hepática; kisspeptin-10 el tratamiento previo reduce la PTT excursión de glucosa, consistente con PEPCK la supresión. La abrazadera euglicémica-hiperinsulinémica con [6,6-2H2]-glucosa o [3-3H]-glucosa marcadora mide la producción de glucosa endógena (EGP) y la eliminación periférica de glucosa (Rd) por separado — el estándar oro para la cuantificación del flujo hepático de glucosa in vivo en kisspeptin-10 investigación metabólica.

Hepático KISS1R la expresión se reduce en NASH biopsias hepáticas (esteatohepatitis no alcohólica) en comparación con el hígado normal (datos de microarray y RNAseq de la publicación) NASH conjuntos de datos; GEO Referencia de adhesión GSE151158 como recurso de acceso público), sugiriendo que kisspeptin la señalización puede interrumpirse en la enfermedad hepática metabólica. In vitro NASH modelos (palmitado) 0.5mM + oleado 1mM esteatosis + LPS 10ng/ml para el golpe inflamatorio en HepG2 o hepatocitos primarios) proporcionan un NASH modelo en el que KISS1R expresión y kisspeptin-10 la capacidad de respuesta puede caracterizarse.

Sexo específico Kisspeptin Biología de la obesidad

Diferencias entre los sexos en kisspeptin-Las interacciones de obesidad son significativas y los diseños de investigación deben tener en cuenta. Las hembras roedores tienen dos kisspeptin poblaciones pertinentes a GnRH Reglamento: ARC KNDy neuronas (como en los hombres) y periventriculares anteroventrales (AVPV) kisspeptin neuronas que generan el pre-ovulatorio LH aumento de la población, una población ausente en los hombres. AVPV kisspeptin número de neuronas y KISS1 la expresión son estrógenos-dependientes, lo que significa que las alteraciones estrógenos asociadas a la obesidad en las mujeres (aromatización de andrógenos en adiposo) modulan diferencialmente la AVPV kisspeptin población en comparación con la población ARC población.

En DIO ratón hembra, el LH la sobrecarga puede evaluarse mediante muestreo de sangre en serie (cada 2 horas durante 48 horas alrededor del tiempo de sobrecarga previsto, basado en la estadificación de la citología vaginal: proestro cornificado → estro — LH pico esperado en la luz-apagada durante el proestro), y kisspeptin-10 de la competencia (c.v. o i.c.v.) se utiliza para comprobar si LH se mantiene la respuesta a la obesidad (positivo kisspeptin confirma la respuesta al desafío GnRH/LH competencia del eje a pesar de la endógena contundente kisspeptin) . Esta lectura específica del sexo requiere una evaluación simultánea con parámetros metabólicos (EchoMRI, insulin tolerancia, GTT) caracterizar la interfaz metabólica-reproductiva en las hembras obesas de investigación.

Diseño experimental para Kisspeptin-10 Investigación sobre la obesidad

Controles clave para kisspeptin-10 la investigación sobre la obesidad incluye: KISS1R antagonista peptide-234 (p234; [D-Tyr5,D-Asn8]-kisspeptin-10 4–10; 1nmol Artículos de la partida 84 o bien 1mg/kg i.p.) para la confirmación de la especificidad del receptor; revuelto kisspeptin-10 (mismo composición, secuencia aleatoria) como control negativo de los péptidos; GnRH antagonista (cetrorelix, antide) para aislar GnRH-efectos metabólicos independientes; leptina receptor knockout (db/db) o global kisspeptin Noche (KISS1-/-) para los modelos genéticos; y leptina recombinante para la comparación de kisspeptin-10 vs señalización directa de leptina en los resultados metabólicos.

Las vías periféricas versus las centrales de administración producen perfiles farmacológicos distintos: Periférico i.p. o s.c. kisspeptin-10 debe cruzar la barrera hematoencefálica para ejercer efectos centrales (BBB penetración es pobre para la longitud completa kisspeptin-54 pero parcial para kisspeptin-10) , mientras que i.c.v. administración kisspeptin-10 directamente a CSF y estructuras periventriculares incluyendo la ARC- ¿Qué? La dosis-respuesta para el periférico kisspeptin-10 efectos sobre LH, insulin, y la ingesta de alimentos debe caracterizarse independientemente para determinar qué concentraciones periféricas producen efectos metabólicos centrales frente a puramente periféricos a través de KISS1R en el adiposo, el hígado y el páncreas.

Resumen de los principales puntos finales de la investigación para Kisspeptin-10 Estudios de obesidad

Los endpoints centrales para la investigación de obesidad con kisspeptina-10 incluyen: ISH/RNAscope de mRNA de KISS1 en ARC en secciones cerebrales de DIO, ELISA seriado de LH (muestreo de vena caudal cada 6 minutos por 3h), AUC de glucosa e insulina en GTT/ITT, insulina de primera/segunda fase de GSIS por perifusión de islotes por HTRF, imagenología de Ca²⁺ de células β con Fura-2 AM, masa grasa/masa magra por EchoMRI, jaula metabólica de ingesta alimentaria acumulada de 24h, calorimetría indirecta VO₂-VCO₂-RER-calor, composición corporal crónica con minibomba Alzet i.c.v. de kisspeptina-10, lipólisis de glicerol/NEFA-C en adipocitos 3T3-L1, DNL con [¹⁴C]-acetato, ELISA de adiponectina total/HMW, fosforilación de PPAR-γ Tyr-273 por CDK5, excursión de glucosa en PTT, trazador de EGP en clamp euglucémico [6,6-²H₂]-glucosa, qPCR hepática de PEPCK/G6Pase, acoplamiento de [¹²⁵I]-GTP-γ-S de KISS1R Gq/Gi, control de especificidad del antagonista de KISS1R p234, y diseño de alimentación pareada para disección de ingesta alimentaria.

Kisspeptin-10 La investigación sobre obesidad ocupa de manera única la intersección de la neuroendocrinología reproductiva y la biología metabólica, convirtiéndola en una valiosa herramienta para estudiar cómo el estado metabólico regula la función reproductiva y viceversa —una conexión bidireccional con creciente relevancia para el síndrome ovárico poliquístico, la amenorrea funcional hipotálamica y el hipogonadismo masculino de los modelos de investigación sobre obesidad.