Kisspeptin-10 e da pesquisa sobre a obesidade: GnRH Mecanismos de modulação do eixo, sinalização metabólica e homeostase energética

Este artigo destina-se apenas a fins de investigação e educação. Kisspeptin-10 é um uso de pesquisa apenas (RUO) composto fornecido para investigação laboratorial. Não está aprovado para uso humano, não é um medicamento e não deve ser administrado a seres humanos ou animais fora de ambientes de investigação licenciados.

Introdução: Kisspeptin na Interseção de Reprodução e Metabolismo

A kisspeptina — o produto do gene KISS1 — é mais conhecida como o neuropeptídeo guardião para a geração de pulsos de GnRH no hipotálamo. No entanto, o receptor KISS1R (GPR54) é expresso muito além do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, com expressão funcional no tecido adiposo, células β pancreáticas, fígado e tecidos metabólicos periféricos — posicionando a kisspeptina na intersecção da regulação reprodutiva e metabólica. Essa dimensão metabólica da biologia da kisspeptina é objeto de crescente interesse de pesquisa, particularmente no contexto da supressão reprodutiva associada à obesidade (hipogonadismo funcional na obesidade), da sinalização de kisspeptina no tecido adiposo, da homeostase da glicose, e da regulação da ingestão de energia.

Kisspeptin-10 — a 10-amino fragmento ácido C-terminal biologicamente ativo (Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2) — conserva a totalidade KISS1R a atividade agonista é a forma de pesquisa mais utilizada. Este post examina a base mecanística para kisspeptin-10A biologia relevante para a obesidade, distinta dos seus papéis estabelecidos na neuroendocrinologia reprodutiva e na pesquisa de fertilidade.

KISS1 e KISS1R Expressão em tecidos metabólicos

KISS1R (GPR54) expressão nos tecidos metabólicos periféricos foi confirmada por RT- Não.PCR, hibridação in situ e imuno-histoquímica no tecido adiposo (ambos WAT Depósitos e BAT) , ilhas pancreáticas (β-cells e α-cells) , fígado e músculo esquelético. KISS1 o aRNm (o precursor do ligante) é expresso em tecido adiposo em si — particularmente em adiposo visceral — aumentando a possibilidade de kisspeptin- Não.KISS1R sinalização autocrina/paracrina em adiposa independente da hipotalâmica kisspeptin Produção.

No hipotálamo, o núcleo arcuato (ARC) kisspeptin neurones co- expressa neurocinina B (NKB) e dinorfina (denominada KNDy neurones) e integrar sinais metabólicos (leptina, insulin, ghrelin, glicose) com GnRH geração de pulso. Os ARC kisspeptin a população é o principal mediador dos efeitos estimuladores da leptina GnRH Pulsatilidade — KISS1R em GnRH neurones recebem kisspeptin a entrada, e ARC kisspeptin a atividade neuronária diminui na obesidade (redução KISS1 ARNm em ARC por hibridação in situ, fornecendo uma explicação mecanística para hipogonadismo hipogonadotrópico associado à obesidade.

KISS1R a expressão em adipócitos é detetável por ligação radioligando ([125I]-kisspeptin-10 Obrigatórias para a concorrência) e funcional HTRF AMPc ou IP1 ensaio (KISS1R casais para Gq-PLCβ-IP₃-Ca2+ na maioria dos tipos de células; também Gi e G12/13 em acoplamento reportado) em diferenciado 3T3-L1 adipócitos e adipócitos primários humanos subcutâneos. O Kd para kisspeptin-10- Não.KISS1R a ligação em adipócitos está na faixa nanomolar baixa, semelhante à afinidade de ligação de tecido hipotalâmico.

Associação de obesidade Kisspeptin Disregulação do sistema

Na obesidade induzida pela dieta (DIO) C57BL/6 ratinhos (HFD 60% de gordura kcal, 12–20 semanas) e ARC KISS1 ARNm é progressivamente reduzida — quantificada por fluorescente ISH (RNAscope) e hibridação in situ em contexto de co-expressão do receptor de leptina (LepR) — correspondente a atenuado GnRH Pulsatilidade e redução LH frequência do pulso (medida por amostragem de sangue de cauda-veína em série a cada 6 minutos durante 3 horas, LH por ultra-sensíveis ELISA; Steyn et al. protocolo). Isso constitui hipogonadismo funcional da obesidade, distinto da falha gonadal primária.

Plasma kisspeptin concentrações em DIO animais (medidos por RIA ou sensíveis ELISA; normal de laboratório de referência 1–10pM em roedores) são reduzidos ou inalterados dependendo da duração e gravidade do modelo. A principal perturbação mecânica não está circulando kisspeptin concentração, mas sim ARC kisspeptin sensibilidade neuronária aos sinais metabólicos — particularmente a leptina, que normalmente estimula ARC kisspeptin neurones via LepRb-JAK2-STAT3 sinalização. Na resistência à leptina central associada à obesidade (hipotálamo atenuado STAT3 pTyr-705 em resposta à leptina periférica), ARC kisspeptin os neurônios recebem uma unidade de leptina trófica insuficiente, reduzindo KISS1 expressão e GnRH Frequência de pulso.

Derivados de adiposos kisspeptin é uma área emergente: KISS1 ARNm em VAT é mensurável pelo qPCR, e VAT o meio condicionado de explante contém kisspeptin-material imunoreactivo detetável por RIA- Não. Na obesidade, VAT KISS1 a expressão é alterada de uma forma específica para as espécies e sexos, e o VAT kisspeptin- Não.KISS1R a loop autocrino em adipócitos é um potencial modificador da função adipócita (metabolismo lípido, secreção de adipocina) separado da hipotálamica kisspeptin- Não.GnRH Biologia.

Kisspeptin-10 e Biologia do Islete Pâncreatico: Insulin Segreção

KISS1R expressão em pancreático β-cells e α-cells fornece uma ligação direta entre kisspeptin e homeostase da glicose. Kisspeptin-10 potencia a estimulação da glicose insulin secreção (GSIS) em islotes isolados de ratos e MIN6 β-cell linha através de Gq-PLCβ-IP₃-SR Ca2+ sinalização — a mesma via que amplifica GSIS em resposta a: GLP-1 E colecistokinina. IPA libertação intracelular de Ca2+ dependente de 3R é mensurável por meio de: Fura-2 AM imagem ratiométrica (340/380nm Razão de excitação) em ilhas isoladas ou MIN6 células perifusadas com 11mM glicose e kisspeptin-10 em 0.1–100nM.

Perifusão dinâmica de islotes (sistema de perifusão de BioRep Technologies; 16 islotes por coluna ECM gel; 11mM estimulação dos passos da glucose; 100µL/min fluxo; 2-minute recolha de frações para insulin RIA ou HTRF) caracteriza a primeira fase (0-10 minutos) e a segunda fase (10-30 minutos) insulin aumento da secreção produzido por kisspeptin-10- Não. O perfil de potenciação semelhante à incretina (aumentação de GSIS sem insulin secreção na glicose basal 2.8mM) posições kisspeptin-10 como um dependente da glicose insulin secretagogue — relevante mecanicamente para a obesidade associada insulin compromisso da secreção.

Na obesidade e na type-2 modelos de roedores diabéticos (ratinhos db/db; ZDF ratos; HFD 16-week C57BL/6) e KISS1R expressão em β-cells é alterado (referido reduzido em alguns modelos, sugerindo regulação compensatória de aumento ou de redução dependendo do estágio da doença e das espécies). Exógenos kisspeptin-10 (1–10nmol/kg i.v. ou i.p.) em DIO animais hiperglicémicos produzem soro mensurável insulin elevações durante o teste de tolerância à glicose (GTT; 2g/kg glicose i.p. no tempo 0, glicemia por glucômetro a −15, 0, 15, 30, 60, 120 minutos) e insulin ensaio de tolerância (ITT; 0.75IU/kg insulin i.p.), com área abaixo da curva de glicose (AUC glicose) e área sob a insulin curva (AUC insulin) como pontos de endpoint primários.

Efeitos do tecido adiposo direto: Lipólise, Lipogênese e Biologia da Adipocina

KISS1R ativação em adipócitos através de Gq-PLCβ-Ca2+-PKC sinalização modula o metabolismo lipídico através de ambos PKC- fosforilação mediada de enzimas reguladoras de lipídios e através de efeitos transcricionais a jusante na expressão de genes lipogênicos. Em diferenciados 3T3-L1 adipócitos (dia 8-12), kisspeptin-10 o tratamento produz efeitos dependentes da concentração na libertação de glicerol (endpoint de lípólise); Incorporação de reagente de glicerol colorimétrico livre) e [14C]-acetato em ácidos graxos (DNL Endpoint; Contagem de cintilação de extração de folhas).

A direção de kisspeptinOs efeitos adipócitos na lipólise são notificados como estimuladores em alguns estudos (PKC-mediado HSL Fosforilação em não-PKA (Gi acoplamento em adipócitos reduzindo aPKA- Não.HSL eixo), sugerindo que KISS1R a estequiometria de acoplamento em adipócitos pode diferir entre os estudos devido às diferenças na linha celular, estado de diferenciação e intervalo de concentração. Os projetos de investigação devem, portanto, incluir [125I]-GTP-γ-S ligando-se para avaliar o padrão de ativação da proteína G (Gq vs Gi vs Gs) na preparação específica de adipócitos utilizada, antes de interpretar os achados lipolíticos/antilipolíticos.

Secreção de adipocina em resposta a kisspeptin-10 inclui adiponectina (anti-inflamatória, insulin- Sensibilização; ELISA em meios condicionados em 24h e 72h) e a leptina (pro-inflamatório em excesso, saciedade-sinal), e resistina. KISS1R em adipócitos pode regular a transcrição da adiponectina através de PPAR-γ — mensuráveis por: PPAR-γ Tyr-273 Fosforilação (CDK5-mediated; inibida por kisspeptin- Não.PLCβ-PKC via) e PPAR-γ-response elemento luciferase repórter em 3T3-L1- Não. Oligomerização da adiponectina (total vs. HMW Razão de adiponectina; cromatografia de filtração de gel) é avaliada separadamente como HMW adiponectina é a forma biológicamente ativa AdipoR1/2- Não.

Central Kisspeptin-10- Não. Circuitos de Balanço de Energia Hipotálâmicos

ARC kisspeptin neurones integrar sinais metabólicos que modulam não apenas GnRH Pulsatilidade, mas também circuitos de homeostase de energia. Os ARC contém duas principais populações neuronais do equilíbrio energético: AgRP/NPY (orexigénico) e POMC/CART Neurônios (anorexigénicos), ambos regulados pela leptina e pelo insulin- Não. ARC kisspeptin os neurônios projetam e recebem projeções de ambas as populações, e kisspeptin-10 Ativos de investimento e outros instrumentos financeiros administração influencia a ingestão de alimentos e o gasto energético de uma forma que é parcialmente GnRH- independente.

Em ratos, kisspeptin-10 Ativos de investimento e outros instrumentos financeiros (1–10nmol em 2µL aCSF) reduz 1-hour e 2-hour realimentação após jejum noturno (medido pela monitorização precisa do equilíbrio contínuo em gaiolas metabólicas individuais), reduz 24-hour consumo cumulativo de alimentos e aumento do gasto energético medido pela calorimetria indireta (gaiolas metabólicas); Consumo de O2 VO2, CO2 produção VCO2, RER = VCO2/VO2, produção de calor pela equação de Lusk). GnRH-a independência destes efeitos é testada por GnRH antagonista (cetrorelix 10µg/kg s.c.) pré-tratamento, ou em GnRH- animais nocauteados.

Central kisspeptin-10 efeitos sobre o peso corporal e a composição ao longo da icv crônica. perfusão (alzet osmótico mini-pump, 7–28 dias, 1nmol/dia) em DIO os ratos fornecem um modelo crônico para pesquisa de homeostase energética. A composição corporal da EchoMRI (massa de gordura, massa magra), a ingestão de alimentos por gaiola metabólica pesagem contínua e a atividade física (locomotor de campo aberto, rotações de rodas em marcha) são os principais endpoints crônicos. Os controlos de alimentação em pares são essenciais para distinguir os efeitos metabólicos directos dos kisspeptin-10 a partir dos efeitos secundários da redução da ingestão de alimentos.

Kisspeptin-10 e Metabolismo Hepático

O fígado expressa KISS1R ARNm e proteínas (RT- Não.PCR e blot ocidental no tecido de biópsia hepática humana e homogenado de fígado de roedores), e hepático kisspeptin a sinalização está implicada na regulação da produção de glicose. Kisspeptin-10 suprime a produção hepática de glicose (HGP) em HepG2 células através de Gq-PLCβ-Ca2+-PKC-mediado PEPCK (fosfoenolpiruvato de carboxiquinase; PCK1) supressão da transcrição, reduzindo a gluconeogênese. Isto é relevante mecanicamente para a sobreprodução hepática de glucose associada à obesidade e hiperglicemia em jejum.

Ensaio de tolerância de piruvado (PTT; 2g/kg de piruvato de sódio i.p. em 18h animais em jejum) fornece uma medida in vivo da capacidade gluconeogénica hepática; kisspeptin-10 o pré-tratamento reduz a PTT excursão de glicose, consistente com PEPCK Supressão. A pinça euglicémica-hiperinsulinêmica com [6,6-2H2]-glucose ou [3-3H]-glucose marcador mide a produção de glucose endógena (EGP) e eliminação periférica da glicose (Rd) separadamente — o padrão ouro para a quantificação do fluxo hepático de glicose in vivo em kisspeptin-10 pesquisa metabólica.

Hepático KISS1R a expressão é reduzida em NASH Biopsias hepáticas (esteato-hepatite não alcoólica) em comparação com o fígado normal (dados microarray e RNAseq de publicação) NASH Conjuntos de dados; GEO Referência à adesão GSE151158 como recurso disponível ao público), sugerindo que kisspeptin a sinalização pode ser interrompida na doença hepática metabólica. In vitro NASH modelos (palmitar 0.5mM + oleado 1mM esteatose + LPS 10ng/ml para o ataque inflamatório em HepG2 ou hepatocitos primários) fornecer um celular NASH modelo em que KISS1R expressão e kisspeptin-10 a capacidade de resposta pode ser caracterizada.

Sexo específico Kisspeptin Biologia da obesidade

Diferenças sexuais em kisspeptin- as interações de obesidade são significativas e os projetos de pesquisa devem ser responsáveis por elas. Roedores fêmeas têm dois kisspeptin Populações relevantes para GnRH Regulamento: ARC KNDy neurones (como em homens) e periventriculares anteroventrais (AVPV) kisspeptin neurones que geram o pré-ovulação LH aumento — uma população ausente nos homens. AVPV kisspeptin número de neurônios e KISS1 a expressão é dependente de estrogênio, ou seja, as alterações estrogênicas associadas à obesidade em fêmeas (aromatização de andrógenos na adiposa) modulam diferencialmente a AVPV kisspeptin população em comparação com a população de ARC população.

Em DIO ratinhos fêmeas, LH a sobrecarga pode ser avaliada por amostragem em série de sangue (a cada 2 horas durante 48 horas em torno do tempo de sobrecarga previsto com base no estadiamento da citologia vaginal: proestro cornificado → estro — LH pico esperado no desligue das luzes durante o proestro), e kisspeptin-10 desafio (c.v.s.) ou i.c.v.) é utilizado para testar se LH a resposta ao aumento de kisspeptin a resposta ao desafio confirma GnRH/LH eixo competência apesar de endógena kisspeptin) . Esta leitura específica do sexo requer avaliação concomitante com parâmetros metabólicos (EchoMRI, insulin tolerância, GTT) caracterizar a interface metabólica-reprodutiva em animais de pesquisa obesos.

Projeto Experimental para Kisspeptin-10 Pesquisa sobre a obesidade

Controlos chave para kisspeptin-10 a pesquisa sobre obesidade inclui: KISS1R antagonista peptide-234 (p234; [D-Tyr5,D-Asn8]-kisspeptin-10 4–10; 1nmol Ativos de investimento e outros instrumentos financeiros ou 1mg/kg i.p.) para confirmação da especificidade do receptor; mexidos kisspeptin-10 (composição idêntica, sequência aleatorizada) como controlo negativo de peptídeos; GnRH antagonista (cetrorelix, antide) para isolar GnRH-efeitos metabólicos independentes; leptina receptor knockout (db/db) ou global kisspeptin Knockout (KISS1-/-) para modelos genéticos; e leptina recombinante para comparação de kisspeptin-10 vs sinalização direta de leptina sobre os desfechos metabólicos.

As vias de administração periférica versus central produzem perfis farmacológicos distintos: a kisspeptina-10 administrada por via i.p. ou s.c. periférica precisa atravessar a barreira hematoencefálica para exercer efeitos centrais (a penetração na BBB é fraca para a kisspeptina-54 de comprimento total, mas parcial para a kisspeptina-10), enquanto a administração i.c.v. entrega a kisspeptina-10 diretamente ao CSF e a estruturas periventriculares, incluindo o ARC. A dose-resposta dos efeitos periféricos da kisspeptina-10 sobre LH, insulina e ingestão alimentar deve ser caracterizada independentemente para estabelecer quais concentrações periféricas produzem efeitos metabólicos centrais versus puramente periféricos através do KISS1R no tecido adiposo, fígado e pâncreas.

Resumo dos principais pontos de fim da investigação para Kisspeptin-10 Estudos de Obesidade

Pontos de avaliação essenciais para kisspeptin-10 a pesquisa sobre obesidade inclui: ARC KISS1 ARNm ISH/ARNscope em DIO secções cerebrais, em série LH ELISA (6-minute amostragem de cauda-veia 3h) e GTT/ITT glicose AUC e insulin AUC, islote de perfusão GSIS primeira/segunda fase insulin por HTRF, Fura-2 AM β-cell Ca2+, massa de gordura/massa límpida do EchoMRI, 24h Gaiola metabólica cumulativa de ingestão de alimentos, calorimetria indireta VO2-VCO2-RER- aquecimento, kisspeptin-10 Ativos de investimento e outros instrumentos financeiros Alzet composição corporal crónica de minipump, glicerol/NEFA- Lipólise C em 3T3-L1 adipócitos, [14C]-acetato DNL, total de adiponectina/HMW ELISA, PPAR-γ Tyr-273 CDK5 Fosforilação, PTT excursão de glicose, pinça euglicémica EGP marcador [6,6-2H2]-glucose, hepática PEPCK/G6Pase qPCR, KISS1R Gq/Gi [125I]-GTP-γ-S acoplamento, p234 KISS1R controle da especificidade antagonista e design de alimentação em pares para dissecção da ingestão de alimentos.

Kisspeptin-10 a pesquisa sobre obesidade ocupa, de forma única, a interseção da neuroendocrinologia reprodutiva e da biologia metabólica, tornando-a uma ferramenta valiosa para estudar como o estado metabólico regula a função reprodutiva e vice-versa – uma conexão bidirecional com crescente relevância para a síndrome ovárica poliquística, amenorréia funcional hipotalâmica e hipogonadismo masculino de modelos de pesquisa sobre obesidade.